Bài 1: Các kỹ thuật cơ bản trong công nghệ gene
1. Tách chiết DNA và Enzyme giới hạn (Restriction Endonuclease)
Công nghệ gene (Recombinant DNA Technology) là quy trình thao tác nhân tạo trên vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử nhằm chuyển một hoặc nhiều gene mục tiêu từ tế bào cho sang tế bào nhận.
- • Phá màng tế bào: Dùng dung dịch đệm ly giải chứa chất tẩy (SDS, Triton X-100) và enzyme lysozyme (với vi khuẩn) để phá hủy màng sinh chất và thành tế bào.
- • Loại bỏ protein & lipid: Dùng enzyme Proteinase K phân giải protein và hỗn hợp Phenol - Chloroform để làm biến tính, kết tủa protein ra khỏi dịch nổi.
- • Thu hồi kết tủa DNA: Cho Ethanol lạnh (hoặc Isopropanol) vào dịch nổi, DNA không tan trong cồn lạnh sẽ kết tủa thành sợi trắng và được ly tâm thu nhận.
- • Nguồn gốc: Được phân lập từ vi khuẩn, đóng vai trò như hệ miễn dịch nguyên thủy cắt phân hủy DNA của thực khuẩn thể (phage) xâm nhập.
- • Tính đặc hiệu: Nhận biết các trình tự nucleotide đối xứng đảo (Palindromic sequence) dài từ 4 - 8 cặp base.
- • Dạng đầu cắt:
- Đầu dính (Sticky ends): Cắt lệch hai mạch (vd: EcoRI nhận biết5'-GAATTC-3', cắt so le giữa G và A để lại các đoạn đơn nhô ra dễ bắt cặp bổ sung).
- Đầu bằng (Blunt ends): Cắt thẳng góc cả hai mạch (vd: SmaI nhận biết5'-CCCGGG-3', cắt giữa C và G).
2. Enzyme nối DNA Ligase & Điện di trên Gel Agarose
Sau khi cắt đoạn DNA mục tiêu và thể truyền (vector), hai phân tử này cần được nối liền và kiểm tra chất lượng:
Enzyme nối DNA Ligase
DNA Ligase (phổ biến nhất là T4 DNA Ligase) xúc tác phản ứng tạo liên kết cộng hóa trị phosphodiester giữa nhóm 3'-OH của chuỗi này với nhóm 5'-phosphate của chuỗi kia với sự tham gia của năng lượng ATP.
Nhờ đầu dính bổ sung với nhau, hiệu suất nối của phân tử DNA cắt bởi cùng một loại enzyme RE là rất cao.
Điện di trên Gel Agarose (Gel Electrophoresis)
Nguyên lý: Khung đường - phosphate của phân tử DNA tích điện âm (-), do đó khi đặt trong điện trường, các phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương (+) qua mạng lưới vi thể của gel agarose.
- • Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ (số bp ít) sẽ di chuyển càng nhanh và càng xa.
- • Nhuộm gel bằng thuốc nhuộm gắn DNA (Ethidium Bromide hoặc GelRed) và soi dưới ánh sáng cực tím (UV) để quan sát các vạch huỳnh quang.
Câu hỏi củng cố kiến thức (4 câu)
1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction Endonuclease) nhận diện trình tự nucleotide đặc hiệu có đặc điểm nào sau đây?
2 Trong kỹ thuật điện di trên gel agarose, các đoạn DNA di chuyển về phía điện cực nào và theo quy luật kích thước ra sao?
3 Enzyme DNA Ligase có chức năng sinh học nào trong công nghệ tạo DNA tái tổ hợp?
4 Hóa chất nào thường được dùng trong bước tách chiết DNA để làm kết tủa và thu hồi sợi DNA ra khỏi dung dịch dịch nổi?